干貨分享—細(xì)胞培養(yǎng)常見問題、可能原因及解決方法

　　問題1：培養(yǎng)液pH 值變化太快

　　可能原因：

　　(1)CO2 張力不對

　　(2)培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊

　　(3)NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足

　　(4)培養(yǎng)液中鹽濃度不正確

　　(5)細(xì)菌、酵母或真菌污染

　　建議解決方法：

　　(1)按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5% 到10%。

　　(2)松開瓶蓋1/4 圈。

　　(3)改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。

　　(4)在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。

　　(5)丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

　　問題2：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變

　　可能原因：

　　(1)洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來

　　(2)冰凍保存培養(yǎng)液

　　建議解決方法：

　　(1)用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。

　　(2)將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。

　　問題3：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時pH 發(fā)生變化

　　可能原因：

　　細(xì)菌或真菌污染

　　建議解決方法

　　丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

　　問題4：培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

　　可能原因：

　　(1)胰蛋白酶消化過度

　　(2)支原體污染

　　(3)培養(yǎng)瓶瓶底不干凈

　　(4)培養(yǎng)液pH值過堿(NaHCO3分解)

　　(5)消化液或培養(yǎng)液配制錯誤、過期儲存、儲存不當(dāng)

　　(6)細(xì)胞老化(如傳代前細(xì)胞已匯合導(dǎo)致失去貼附性)

　　(7)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高

　　建議解決方法：

　　(1)縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。

　　(2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　(3)注意刷洗，或換用一次性塑料培養(yǎng)瓶

　　(4)使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2(將培養(yǎng)液敞口放入培養(yǎng)箱也可)

　　(5)重新配置消化液或培養(yǎng)液

　　(6)啟用新的保種細(xì)胞

　　(7)調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度

　　問題5：懸浮細(xì)胞成簇

　　可能原因：

　　(1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子

　　(2)支原體污染

　　(3)蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋

　　(4)DNA污染

　　建議解決方法：

　　(1)用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。

　　(2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　(3)用DNase I 處理細(xì)胞。

　　問題6：原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染

　　可能原因：

　　原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染

　　建議解決方法：

　　培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。

　　問題7：培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢

　　可能原因：

　　(1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清

　　(2)培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。

　　(3)培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染

　　(4)試劑保存不當(dāng)

　　(5)接種細(xì)胞起始濃度太低

　　(6)細(xì)胞已老化

　　(7)支原體污染

　　建議解決方法：

　　(1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。

　　(2)換入新鮮配制培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子。

　　(3)用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。

　　(4)血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2 周內(nèi)用完。

　　(5)增加接種細(xì)胞起始濃度。

　　(6)換用新的保種細(xì)胞。

　　(7)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

　　問題8：培養(yǎng)細(xì)胞死亡

　　可能原因：

　　(1)培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2

　　(2)培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大

　　(3)細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷

　　(4)培養(yǎng)液滲透壓不正確

　　(5)培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積

　　(6)更多原因參考問題4和問題7

　　建議解決方法：

　　(1)檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2

　　(2)檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度

　　(3)取新的保存細(xì)胞種

　　(4)檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

　　(5)換入新鮮培養(yǎng)液

　　(6)更多解決方法參考問題4和問題7

　　細(xì)胞培養(yǎng)板本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。