Elisa實(shí)驗(yàn)| 雙抗體夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)操作

　　一、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋及樣品準(zhǔn)備

　　樣本離心4℃，1000Xg，5min

　　標(biāo)準(zhǔn)品離心4℃，10000Xg，1min

　　1mL稀釋液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，靜置1-2min，取7支空EP管，每管加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液，靜置后標(biāo)準(zhǔn)品混勻，將液體離心至底部(800Xg，1min)

　　取同體積標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋，渦旋混勻，依次倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，最后一管為空白

　　二、酶標(biāo)板拆分

　　可按照實(shí)驗(yàn)需求拆裝板條，讓板條松動(dòng)并輕推底部，拆下板條防止在備用板框上，剩余板條防至鋁箔袋，封口存放。

　　三、標(biāo)準(zhǔn)品及樣本點(diǎn)樣

　　由低到高濃度，每孔100μL，懸空加入(建議均設(shè)置復(fù)孔)

　　處理后樣品取上清溶液，懸空，每孔100μL，腹膜后標(biāo)記。提前預(yù)熱，注意溫度，37℃孵育90min。

　　四、生物s化抗體工作液制備

　　取適量生物素化抗體稀釋液，加入濃縮液，稀釋100倍后，顛倒混勻20次，待用。

　　取出酶標(biāo)板，勿觸摸板條底部，甩盡孔內(nèi)液體后，拍干。將工作液倒入加樣槽，懸空垂直加入，100μL/孔，腹膜后標(biāo)記，37℃孵育60min。

　　五、1x洗液配制

　　根據(jù)需求取雙蒸水適量，取25x濃縮洗滌液適量，加入燒杯，磁力攪拌器混勻5-10min。

　　六、濃縮HRP酶結(jié)合物工作液制備

　　取適量HRP酶結(jié)合物稀釋液，加入濃縮液，稀釋100倍后，顛倒混勻20次，備用

　　取出酶標(biāo)板，勿觸摸板條底部。輕撕覆膜，避免液體濺出。參數(shù)設(shè)定：洗滌次數(shù)3次、洗板條數(shù)12條、洗滌液量350μL/孔、震板5s。拍干液體，更換吸水紙。將工作液倒入加樣槽，懸空垂直加入，100μL/孔，腹膜后標(biāo)記，37℃孵育30min。

　　七、顯色

　　平衡取出酶標(biāo)板勿觸摸板條底部，輕撕覆膜，避免液體濺出，參數(shù)設(shè)定。洗滌次數(shù)5從，洗板條數(shù)12條，洗滌液量350μL/孔，震板5s。拍干液體，更換吸水紙。

　　將底物溶液倒入加樣槽，懸空垂直加入，90μL/孔，腹膜后標(biāo)記，37℃孵育15-30min。

　　八、終止反應(yīng)

　　平衡取出酶標(biāo)板，切勿觸摸板條底部，顯色后前四孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色剃度。輕撕覆膜，避免液體濺出。懸空垂直加入，50μL/孔，加入終止液時(shí)可看到藍(lán)色立轉(zhuǎn)為黃色。

　　九、數(shù)據(jù)處理

　　輕輕擦拭板底，放入酶標(biāo)儀中，上機(jī)操作。

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