本生資訊：考馬斯藍(lán)染料原理、使用步驟匯總

　　考馬斯藍(lán)染料簡(jiǎn)介：

　　考馬斯藍(lán)廣泛用于瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)的可視化。

　　考馬斯亮藍(lán)R250(紅色染成藍(lán)色)電泳(更靈敏：可以檢測(cè)到0.1微克蛋白質(zhì))，考馬斯藍(lán)G250(淺綠色藍(lán)色)用于溶液中的蛋白質(zhì)分析(方便-可溶)。兩者都可以用于每種應(yīng)用中，但是它們可以互換使用，因?yàn)樗鼈兛梢詫⒌鞍踪|(zhì)染色成不同的強(qiáng)度和顏色。

　　考馬斯藍(lán)染料技術(shù)說(shuō)明：

　　考馬斯藍(lán)R-250和G-250染料是考馬斯染料的兩種最常見(jiàn)的化學(xué)形式，是二磺化的三苯基甲/烷化合物。R-250(紅色)缺少以G-250(綠色)形式存在的兩個(gè)甲基。“250"最初表示染料的純度。

　　考馬斯藍(lán)染色原理：

　　不同的顏色是染料分子不同帶電狀態(tài)的結(jié)果。

　　當(dāng)pH值小于0時(shí)，考馬斯藍(lán)G250染料會(huì)腐蝕所有帶正電荷的三個(gè)氮原子，顏色為紅色最大吸收波長(zhǎng)為465nm。當(dāng)pH值約為1時(shí)，染料的總電荷為+1(2-磺酸基團(tuán)帶負(fù)電，因?yàn)樗鼈兊膒Ka極低)，所以染料是綠色的，具有吸收能力最大值為620nm，而pH值高于2時(shí)，染料為亮藍(lán)色，最大值為595nm。在pH值為7時(shí),二苯/胺部分帶正電荷，總電荷為?1，染料消光系數(shù)為43 000 M?1厘米?1.

　　染料與蛋白質(zhì)的氨基和羧基(非共價(jià))靜電相互作用，因此主要來(lái)自堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴氨酸、組氨酸)，以及疏水性氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸、色氨酸)。當(dāng)在pH=3.0的0.01M檸檬酸鹽緩沖液中溶解時(shí)，考馬斯的最大吸收波長(zhǎng)為555nm;蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的特征是峰略寬于游離染料的峰，最大值為549nm。

　　考馬斯凝膠染色劑和布拉德福德蛋白質(zhì)分析試劑是以25-50%甲醇中的極酸性溶液配制的。在酸性條件下，染料主要通過(guò)堿性氨基酸(主要是精氨酸、賴氨酸和組氨酸)與蛋白質(zhì)結(jié)合，而絡(luò)合物的形成穩(wěn)定了產(chǎn)生藍(lán)色的染料的負(fù)電荷陰離子形式。每個(gè)蛋白質(zhì)分子結(jié)合的考馬斯染色配體的數(shù)量約為與蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)的正電荷數(shù)成正比。蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致染料從紅棕色至亮藍(lán)色(最大吸收波長(zhǎng)為595nm)。

　　考馬斯藍(lán)G-250染料的水溶性在膠體考馬斯染色方案中得到了很好的應(yīng)用。

　　溶液中蛋白質(zhì)測(cè)定-布拉德福德法

　　1. 著色溶液成分：5%考馬斯藍(lán)G250

　　2. 著色溶液制備：

　　a.將50mg考馬斯藍(lán)G250溶于50ml甲醇中

　　b.從步驟1開(kāi)始向溶液中加入100ml 85%H3PO4

　　c.將步驟2的溶液加入500ml H2O中，混勻

　　d.過(guò)濾以去除任何沉淀物

　　e.再添加350ml H2O和miw 儲(chǔ)存于4°C。

　　3. 分析流程20-150 µg 蛋白; 200-1500 µg/mL

　　a. 準(zhǔn)備0.15M NaCl溶液稀釋至最終濃度為250、，500、750和1500微克/毫升濃度。同時(shí)準(zhǔn)備待測(cè)樣品稀釋液。

　　b. 向單獨(dú)的試管(或分光光度計(jì)試管)中添加100µL蛋白至以上濃度NaCl稀釋液中。

　　c. 再向每個(gè)試管中添加5.0mL考馬斯藍(lán)，通過(guò)渦流或倒置進(jìn)行混合。

　　d. 將分光光度計(jì)調(diào)整到595nm的波長(zhǎng)，并使用不含蛋白質(zhì)的試管進(jìn)行空白。

　　e. 等待5分鐘，在595nm波長(zhǎng)下讀取每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和每個(gè)樣品。

　　f. 繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與蛋白濃度的關(guān)系。計(jì)算消光系數(shù)并計(jì)算未知樣本的濃度。

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