實(shí)驗(yàn)原理：做ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)如何操作?
 

　　ELISA實(shí)驗(yàn)原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。

　　酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。

　　因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

　　ELISA實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng):

　　1、固相載體選擇

　　聚苯乙x：具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。

　　聚氯乙x：聚氯乙x對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙x高，但空白值也略高。

　　良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。

　　2、包被

　　①板孔的選擇：ELISA別的微孔板。

　　②抗體選擇：選擇支持ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體，根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索適濃度。

　　③包被緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。

　　④包被溫度：2-8 ℃過(guò)夜包被或室溫(37℃)包被2h。

　　⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。

　　3、封閉

　　①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體)。

　　②選擇效果較好的封閉劑(細(xì)胞培養(yǎng)BSA、Tween等)。

　　4、加樣及孵育

　　①加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

　　②孵育的時(shí)間及溫度參考試劑盒說(shuō)明書。如有條件，建議加樣孵育時(shí)使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm，轉(zhuǎn)速在500±50rpm。

　　③檢測(cè)抗體、酶標(biāo)物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時(shí)間嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書提示。

　　④洗板對(duì)于ELISA來(lái)說(shuō)，是其關(guān)鍵的一步，保證ELISA的特異性。

　　⑤封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

　　5、顯色和終止

　　①使用需檢查，底物在加入96孔板之應(yīng)為無(wú)色透明。

　　②顯色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免污染。

　　③孵育時(shí)間，說(shuō)明書上為參考范圍，具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件自行摸索。可參考標(biāo)曲濃度大孔的顏色，變?yōu)樗{(lán)色較明顯時(shí)即可。

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